Modelowanie przez homologię

2012-01-27T16:15:18Z

Mkolin:

==Modelowanie przez homologię==
W przypadku, gdy dysponujemy białkiem homologicznym, szablonem (ang. template), wykazującym pewne podobieństwo sekwencyjne o znanej strukturze przestrzennej, budowę modelu rozpoczynamy od prawidłowego dopasowania sekwencji (uliniowienia sekwencji, ang. sequence alignment). W przypadku gdy dwa białka pochodzą od wspólnego przodka, jednego białka pierwotnego, sekwencje aminokwasów ulęgały zmianom podczas procesu ewolucji na skutek zachodzących substytucji (podstawienia), insercji (wstawienia) lub delecji (usunięcia). Algorytmy stosowane do uliniowienia (porównania) sekwencji białkowych w większości przypadków oparte są na metodzie Needlemana i Wunscha [1]. W celu poprawnego dopasowania dwóch sekwencji stosowana jest macierz podobieństwa (ang. comparison matrix), 20´20 odpowiadająca dwudziestu aminokwasom, na podstawie, której dopasowywane reszty są odpowiednio punktowane. Liczba punktów zależy od charakteru pokrywających się par aminokwasów w uliniowionych sekwencjach. Reszty identyczne są oceniane najwyżej. Odpowiednia liczba punktów przydzielana jest zależnie od typu stosowanej macierzy, na podstawie wspólnych cech fizykochemicznych danych reszt (ładunku, polarności, rozmiaru i innych cech), prawdopodobieństwa wystąpienia danej mutacji, charakteru hydrofobowego czy hydrofilowego oraz na podstawie kodu genetycznego, uwzględniając liczbę zmian jakie musiały zajść w kodzie RNA lub DNA (kodonach definiujących poszczególne aminokwasy) aby zmiana aminokwasu była możliwa. Algorytm przydziela również punkty karne za przerwy w sekwencji (ang. gap penalty). W niektórych przypadkach algorytm optymalizując liczbę przyznanych punktów jest w stanie poprawnie dopasować badane sekwencje.

Poprawne uliniowienie sekwencji jest warunkiem koniecznym dla otrzymania prawidłowej struktury białka. Ten etap modelowania jest też bardzo podatny na błędy. Analizując wykonane ustawienie sekwencji należy zwrócić szczególną uwagę na fragmenty łańcucha odpowiedzialne za strukturę drugorzędową (b-kartki lub a-helis), lokalizację mostków disulfidowych (par cystein) oraz prolin. Bardzo istotne jest także prawidłowe dopasowanie fragmentów sekwencji obecnych w miejscach odpowiedzialnych za funkcje danego białka, w miejscach wiążących ligandy oraz motywów (fragmentów sekwencji) charakterystycznych dla danej rodziny białek. Pomocne w identyfikacji wyżej wymienionych obszarów może być wykonanie uliniowienia wielu różnych sekwencji białek (ang. multiple sequenece alignment) należących do tej samej rodziny lub, w niektórych przypadkach, białek pełniących podobną funkcję.

Szacuje się, że jeśli podobieństwo sekwencyjne między szablonem a budowanym białkiem przekracza 50%, otrzymany model wykazuje dużą dokładność (podobieństwo do struktury natywnej) porównywalną z dokładnością metod NMR. Podstawowe błędy mogą dotyczyć wtedy upakowania łańcuchów bocznych aminokwasów. Podobieństwo sekwencyjne między 30%-50% może prowadzić do niewłaściwego dopasowania odcinków sekwencji, a w rezultacie do otrzymania błędnej konformacji dla poszczególnych fragmentów łańcucha peptydowego, zwłaszcza w rejonie pętli. Przyjmuje się, iż podobieństwo sekwencji niższe niż 30% jest zwykle niewystarczające do otrzymania prawidłowego modelu białka.

Następnym etapem modelowania przez homologię jest przepisanie współrzędnych z szablonu (białka o znanej strukturze przestrzennej) na poszczególne atomy budowanego białka na podstawie wykonanego wcześniej uliniowienia sekwencji. Jednym z programów pozwalającym na przewidywanie struktury przestrzennej białek za pomocą metod porównawczych jest MODELLER [2-4]. W programie tym współrzędne atomów budowanego białka definiowane są za pomocą więzów (ang. restraints) przestrzennych pobranych bezpośrednio ze struktury szablonu.

Często jednak zdarza się, że w uliniowionych sekwencjach występują przerwy (ang. gaps). Ma to miejsce głównie w obszarze pętli modelowanej cząsteczki. W programie MODELLER znalezienie odpowiedniej konformacji dla tych fragmentów odbywa się dwiema metodami. W przypadku krótkich pętli (poprawne rezultaty otrzymujemy z reguły dla fragmentów poniżej 7 aminokwasów) program automatycznie generuje losowe ułożenie przestrzenne aminokwasów, a następnie optymalizuje geometrię dodanego fragmentu. W przypadku dłuższych pętli, program przeszukuje bazę znanych struktur przestrzennych białek (PDB) w celu odszukania fragmentu łańcucha białkowego wykazującego jak największe podobieństwo sekwencyjne. Program ocenia również czy struktura pętli, zbudowana na podstawie tak odszukanego fragmentu, będzie mogła być poprawnie dopasowana do pozostałej części modelowanego białka. Po wstawieniu brakującej części łańcucha białkowego, jego geometria jest dodatkowo optymalizowana.
==Ocena modelu==
Otrzymany model białka należy poddać ocenie, aby zweryfikować poprawność struktury i jego przydatność do dalszych badań. Pierwszym kryterium jest jego ocena wizualna. Bardzo użyteczne na tym etapie są dane strukturalne pochodzące z badań eksperymentalnych. Na ich podstawie możemy w niektórych przypadkach zweryfikować obecność wiązań disulfidowych w łańcuchu peptydowym, miejsc wiązania ligandów, a nawet odległości pomiędzy poszczególnymi resztami. Niestety, rzadko dysponujemy taką wiedzą. Dlatego w celu wykrycia ewentualnych nieprawidłowości w zbudowanym modelu należy skorzystać z dostępnych programów umożliwiających ocenę struktury białka.

Program PROCHECK [5] pozwala na analizę geometrii oraz stereochemii modelowanej cząsteczki. Program ten sprawdza wartości kątów φ i ψ, wartości kątów płaskich, planarność wiązań peptydowych, długości wiązań między atomami oraz konformację łańcuchów bocznych aminokwasów, a także geometrie wiązań wodorowych. Zmierzone wartości oraz parametry łańcucha białkowego zbudowanego modelu mogą być następnie zestawione z odpowiadającymi im wartościami, pochodzącymi ze znanych struktur krystalicznych białek.

Metoda Verify3D [6, 7] pozwala na ocenę prawidłowego upakowania aminokwasów w łańcuchu peptydowym przez ocenę kompatybilności danej reszty z jej otoczeniem. Program sprawdza, między innymi wzajemne położenie aminokwasów o właściwościach hydrofilowych i hydrofobowych, ekspozycje reszt naładowanych na zewnątrz białka oraz tendencje do przyjmowania przez dane aminokwasy określonej struktury drugorzędowej. Profil weryfikujący poprawność modelu powstaje przez przyznanie każdej z reszt określonej punktacji. Liczba przyznawanych punktów oparta jest na statystycznej preferencji występowania każdego z 20 aminokwasów w określonym otoczeniu, jaka jest obserwowana w znanych strukturach białek.
Aby ocena modelu była wiarygodna należy korzystać z jak największej liczby dostępnych metod i narzędzi pomocnych w ocenie struktury przestrzennej budowanego białka, między innymi takich jak: Proq [8], Anolea [9-11], ProsaII [12, 13]. W przypadku stwierdzenia błędów w strukturze zbudowanego modelu należy wrócić do poprzednich etapów modelowania (wyboru szablonu, uliniowienia sekwencji…itd.) w celu usunięcia możliwych błędów lub doboru innych parametrów. Poprawnie oceniony model należy poddać dalszej optymalizacji geometrii, a następnie zbadać jego stabilność z zastosowaniem metod mechaniki molekularnej.
==Literatura==
# Needleman, S.B. and C.D. Wunsch, A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol, 1970. 48(3): p. 443-53.
# Eswar, N., et al., Protein structure modeling with MODELLER. Methods Mol Biol, 2008. 426: p. 145-59.
# Eswar, N., et al., Comparative protein structure modeling using MODELLER. Curr Protoc Protein Sci, 2007. Chapter 2: p. Unit 2 9.
# Sali, A., et al., Evaluation of comparative protein modeling by MODELLER. Proteins, 1995. 23(3): p. 318-26.
# Laskowski, R.A., et al., PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Cryst., 1993. 26: p. 283-291.
# Bowie, J.U., R. Luthy, and D. Eisenberg, A method to identify protein sequences that fold into a known three-dimensional structure. Science, 1991. 253(5016): p. 164-70.
# Luthy, R., J.U. Bowie, and D. Eisenberg, Assessment of protein models with three-dimensional profiles. Nature, 1992. 356(6364): p. 83-5.
# Schwarzenbacher, R., et al., The importance of alignment accuracy for molecular replacement. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2004. 60(Pt 7): p. 1229-36.
# Melo, F., et al., ANOLEA: a www server to assess protein structures. Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol, 1997. 5: p. 187-90.
# Melo, F. and E. Feytmans, Novel knowledge-based mean force potential at atomic level. J Mol Biol, 1997. 267(1): p. 207-22.
# Melo, F. and E. Feytmans, Assessing protein structures with a non-local atomic interaction energy. J Mol Biol, 1998. 277(5): p. 1141-52.
# Sippl, M.J., Recognition of errors in three-dimensional structures of proteins. Proteins, 1993. 17(4): p. 355-62.
# Wiederstein, M. and M.J. Sippl, ProSA-web: interactive web service for the recognition of errors in three-dimensional structures of proteins. Nucleic Acids Res, 2007. 35(Web Server issue): p. W407-10.

2012-01-27T14:11:27Z

Mkolin:

Opsyna w stanie aktywnym

2012-01-27T14:10:57Z

Mkolin:

==Opsyna w stanie aktywnym==
[[Image:opsyna_aktywna.jpg|thumb|upright|400px| Rys. 1. a) Nałożenie struktury rodopsyny w stanie podstawowym (kolor zielony, PDB ID: 1U19) [8] oraz opsyny w stanie aktywnym (kolor pomarańczowy, PDB ID: 3DQB) [2]. Kolorem niebieskim oznaczono GαCT (peptyd identyczny z C-końcową częścią podjednostki α białka G). Cyfry od 1 do 7 oznaczają TMH:I do TMH:VII. b) Schemat przedstawiający różnice w strukturze rodopsyny oraz w strukturze opsyny w kompleksie z GαCT, widok od strony cytoplazmatycznej. Rysunek wykonany na podstawie pracy [2].]]

Dzięki postępom w metodach krystalograficznych, a w szczególności technice mikroogniskowania, w 2008 roku udało się skrystalizować opsynę (rodopsyna bez retinalu) [1] oraz uzyskać strukturę kompleksu opsyny z C-końcową częścią podjednostki α białka G (GαCT) [2]. Część podjednostki α białka G wnika w głąb rodopsyny i uczestniczy bezpośrednio w przeniesieniu sygnału z aktywnego receptora na białko G.

Absorpcja kwantu światła, powodująca izomeryzacę retinalu, prowadzi do zmian konformacyjnych w strukturze rodopsyny. Receptor przechodzi przez szereg stanów pośrednich (częściowo aktywnych), osiągając ostatecznie formę całkowicie aktywną (zwaną metarodopsyną II) [3], zdolną do wiązania białka G. Podczas tego procesu, zasada Schiffa ulega hydrolizie, co umożliwia oddysocjowanie całkowicie-trans-retinalu z miejsca wiązania w rodopsynie. Następnie, z udziałem izomerazy, uwolniony ligand zostaje przekształcony z powrotem do formy 11-cis. Cząsteczka opsyny wiąże się z 11-cis-retinalem, co inicjuje kolejny cykl aktywacyjny [4]. Aby jednak aktywna rodopsyna lub opsyna nie powodowała stałej aktywacji białek G, a w konsekwencji całej komórki pręcikowej, istnieje mechanizm wygaszania receptora. W pierwszej kolejności aktywna rodopsyna jest fosforylowana przez kinazę rodopsynową, a następnie do takiej rodopsyny przyłącza się arestyna. Ponieważ rodopsyna ulega oligomeryzacji sądzi się, że arestyna tworzy kompleks z dimerem rodopsyny [5, 6].

Opsyna jest niestabilna konformacyjnie i może istnieć zarówno w formie aktywnej jak i nieaktywnej (tzw. stan podstawowy). Wykazano, iż niska wartość pH oraz obecność GαCT (krótkich łańcuchów peptydowych, identycznych z C-końcową częścią podjednostki α białka G), dodatkowo stabilizują stan aktywny opsyny [7].

Porównując dwie struktury charakterystyczne dla stanu podstawowego rodopsyny (PDB ID: 1U19) [8] oraz formy aktywnej białka (PDB ID: 3DQB) [2], zaobserwować można duże zmiany w położeniu helis: TMH:V do TMH:VII. Natomiast struktura „rdzenia białka”, tworzona przez helisy: TMH:I do TMH:IV oraz położenie pętli zewnątrzkomórkowych EL:I do EL:III wraz z domeną N-końcową, są prawie niezmieniona (Rys. 1).

W strukturze opsyny część cytoplazmatyczna TMH:VI jest odchylona o 7 Å na zewnątrz białka [2]. Miejscem zgięcia helisy jest reszta TRP:6.48, której położenie w nieaktywnej strukturze rodopsyny jest stabilizowane przez związany 11-cis-retinal. W strukturze opsyny widocznym zmianom podlega również helisa TMH:V. Jest ona przesunięta w kierunku TMH:VI oraz wydłużona o trzy skręty helisy. Skutkuje to znacznym skróceniem pętli IL:III po stronie cytoplazmatycznej błony. Również połowa TMH:VII, zlokalizowana po wewnątrzkomórkowej stronie błony, jest przesunięta do środka receptora, co zmienia konformację części łańcucha łączącego ją z helisą VIII położoną prostopadle do błony. Różnice w lokalizacji poszczególnych helis wpływają na strukturę trzech pętli: IL:I do IL:III. Prowadzi to do zmiany kształtu powierzchni cytoplazmatycznej receptora w formie aktywnej, która jest interfejsem biorącym udział w wiązaniu białka G (transducyny).

Przeprowadzenie rodopsyny ze stanu nieaktywnego do formy aktywnej (metarodopsyny II) wymaga zerwania oddziaływań wewnątrzcząsteczkowych odpowiedzialnych za stabilizację stanu podstawowego receptora. Kluczowe zmiany zachodzą wówczas w miejscu występowania dobrze zachowanych ewolucyjnie u wszystkich receptorów GPCR z rodziny A, motywów: E(D)RY, NPxxY (Rys. 2), w miejscu wiązania retinalu, jak i również w położeniu części cytoplazmatycznej helis: TMH:IV do TMH:VII [3, 9-12].

Sieć oddziaływań jonowych (tzw. ''ang. „ionic lock”'') tworzona przez Arg:3.50 i Glu:3.49 z motywu E(D)RY (obecnego na TMH:III) oraz oddziałujące z nimi Glu:6.30 i Thr:6.34 z TMH:VI, stabilizuje wzajemne położenie dwóch helis [8]. Połączenie to zostaje jednak zerwane podczas aktywacji receptora na skutek ruchu TMH:VI. Zmiana położenia części cytoplazmatycznej TMH:V w stronę TMH:VII prowadzi do powstania wnęki po stronie wewnątrzkomórkowej opsyny, pozwalającej na wiązanie GαCT. Łańcuch boczny Arg:3.50 tworząc wiązanie wodorowe z Tyr:5.58, zmienia swoją orientację w kierunku wnętrza receptora. Pozwala to na bezpośrednie oddziaływanie naładowanego łańcucha bocznego Arg:3.50, z grupą karbonylową cysteiny obecnej na C-końcu wiązanej podjednostki GαCT. Dodatkowo, za stabilizację formy aktywnej receptora, jak i również powstałej wnęki, odpowiada Tyr:7.53 obecna w motywie NPxxY [2]. Pierścień Tyr:7.53 (która w stanie nieaktywnym oddziałuje z Phe:313 z helisy ósmej) skierowany do środka receptora, zapobiega zmianie położenia TMH:VI (Rys. 2).

==Literatura==
# Park, J.H., et al., Crystal structure of the ligand-free G-protein-coupled receptor opsin. Nature, 2008. 454(7201): p. 183-7.
# Scheerer, P., et al., Crystal structure of opsin in its G-protein-interacting conformation. Nature, 2008. 455(7212): p. 497-502.
# Knierim, B., et al., Sequence of late molecular events in the activation of rhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(51): p. 20290-5.
# Okada, T., et al., Activation of rhodopsin: new insights from structural and biochemical studies. Trends Biochem Sci, 2001. 26(5): p. 318-24.
# Modzelewska, A., et al., Arrestin interaction with rhodopsin: conceptual models. Cell Biochem Biophys, 2006. 46(1): p. 1-15.
# Liang, Y., et al., Rhodopsin signaling and organization in heterozygote rhodopsin knockout mice. J Biol Chem, 2004. 279(46): p. 48189-96.
# Vogel, R. and F. Siebert, Conformations of the active and inactive states of opsin. J Biol Chem, 2001. 276(42): p. 38487-93.
# Okada, T., et al., The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 A crystal structure. J Mol Biol, 2004. 342(2): p. 571-83.
# Fritze, O., et al., Role of the conserved NPxxY(x)5,6F motif in the rhodopsin ground state and during activation. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(5): p. 2290-5.
# Grobner, G., et al., Observations of light-induced structural changes of retinal within rhodopsin. Nature, 2000. 405(6788): p. 810-3.
# Sheikh, S.P., et al., Rhodopsin activation blocked by metal-ion-binding sites linking transmembrane helices C and F. Nature, 1996. 383(6598): p. 347-50.
# Farrens, D.L., et al., Requirement of rigid-body motion of transmembrane helices for light activation of rhodopsin. Science, 1996. 274(5288): p. 768-70.

Opsyna w stanie aktywnym

2012-01-27T14:10:04Z

Mkolin:

==Opsyna w stanie aktywnym==
Dzięki postępom w metodach krystalograficznych, a w szczególności technice mikroogniskowania, w 2008 roku udało się skrystalizować opsynę (rodopsyna bez retinalu) [1] oraz uzyskać strukturę kompleksu opsyny z C-końcową częścią podjednostki α białka G (GαCT) [2]. Część podjednostki α białka G wnika w głąb rodopsyny i uczestniczy bezpośrednio w przeniesieniu sygnału z aktywnego receptora na białko G.

Absorpcja kwantu światła, powodująca izomeryzacę retinalu, prowadzi do zmian konformacyjnych w strukturze rodopsyny. Receptor przechodzi przez szereg stanów pośrednich (częściowo aktywnych), osiągając ostatecznie formę całkowicie aktywną (zwaną metarodopsyną II) [3], zdolną do wiązania białka G. Podczas tego procesu, zasada Schiffa ulega hydrolizie, co umożliwia oddysocjowanie całkowicie-trans-retinalu z miejsca wiązania w rodopsynie. Następnie, z udziałem izomerazy, uwolniony ligand zostaje przekształcony z powrotem do formy 11-cis. Cząsteczka opsyny wiąże się z 11-cis-retinalem, co inicjuje kolejny cykl aktywacyjny [4]. Aby jednak aktywna rodopsyna lub opsyna nie powodowała stałej aktywacji białek G, a w konsekwencji całej komórki pręcikowej, istnieje mechanizm wygaszania receptora. W pierwszej kolejności aktywna rodopsyna jest fosforylowana przez kinazę rodopsynową, a następnie do takiej rodopsyny przyłącza się arestyna. Ponieważ rodopsyna ulega oligomeryzacji sądzi się, że arestyna tworzy kompleks z dimerem rodopsyny [5, 6].

Opsyna jest niestabilna konformacyjnie i może istnieć zarówno w formie aktywnej jak i nieaktywnej (tzw. stan podstawowy). Wykazano, iż niska wartość pH oraz obecność GαCT (krótkich łańcuchów peptydowych, identycznych z C-końcową częścią podjednostki α białka G), dodatkowo stabilizują stan aktywny opsyny [7].

[[Image:opsyna_aktywna.jpg|thumb|upright|400px| Rys. 1. a) Nałożenie struktury rodopsyny w stanie podstawowym (kolor zielony, PDB ID: 1U19) [8] oraz opsyny w stanie aktywnym (kolor pomarańczowy, PDB ID: 3DQB) [2]. Kolorem niebieskim oznaczono GαCT (peptyd identyczny z C-końcową częścią podjednostki α białka G). Cyfry od 1 do 7 oznaczają TMH:I do TMH:VII. b) Schemat przedstawiający różnice w strukturze rodopsyny oraz w strukturze opsyny w kompleksie z GαCT, widok od strony cytoplazmatycznej. Rysunek wykonany na podstawie pracy [2].]]

Porównując dwie struktury charakterystyczne dla stanu podstawowego rodopsyny (PDB ID: 1U19) [8] oraz formy aktywnej białka (PDB ID: 3DQB) [2], zaobserwować można duże zmiany w położeniu helis: TMH:V do TMH:VII. Natomiast struktura „rdzenia białka”, tworzona przez helisy: TMH:I do TMH:IV oraz położenie pętli zewnątrzkomórkowych EL:I do EL:III wraz z domeną N-końcową, są prawie niezmieniona (Rys. 1).

W strukturze opsyny część cytoplazmatyczna TMH:VI jest odchylona o 7 Å na zewnątrz białka [2]. Miejscem zgięcia helisy jest reszta TRP:6.48, której położenie w nieaktywnej strukturze rodopsyny jest stabilizowane przez związany 11-cis-retinal. W strukturze opsyny widocznym zmianom podlega również helisa TMH:V. Jest ona przesunięta w kierunku TMH:VI oraz wydłużona o trzy skręty helisy. Skutkuje to znacznym skróceniem pętli IL:III po stronie cytoplazmatycznej błony. Również połowa TMH:VII, zlokalizowana po wewnątrzkomórkowej stronie błony, jest przesunięta do środka receptora, co zmienia konformację części łańcucha łączącego ją z helisą VIII położoną prostopadle do błony. Różnice w lokalizacji poszczególnych helis wpływają na strukturę trzech pętli: IL:I do IL:III. Prowadzi to do zmiany kształtu powierzchni cytoplazmatycznej receptora w formie aktywnej, która jest interfejsem biorącym udział w wiązaniu białka G (transducyny).

Przeprowadzenie rodopsyny ze stanu nieaktywnego do formy aktywnej (metarodopsyny II) wymaga zerwania oddziaływań wewnątrzcząsteczkowych odpowiedzialnych za stabilizację stanu podstawowego receptora. Kluczowe zmiany zachodzą wówczas w miejscu występowania dobrze zachowanych ewolucyjnie u wszystkich receptorów GPCR z rodziny A, motywów: E(D)RY, NPxxY (Rys. 2), w miejscu wiązania retinalu, jak i również w położeniu części cytoplazmatycznej helis: TMH:IV do TMH:VII [3, 9-12].

Sieć oddziaływań jonowych (tzw. ''ang. „ionic lock”'') tworzona przez Arg:3.50 i Glu:3.49 z motywu E(D)RY (obecnego na TMH:III) oraz oddziałujące z nimi Glu:6.30 i Thr:6.34 z TMH:VI, stabilizuje wzajemne położenie dwóch helis [8]. Połączenie to zostaje jednak zerwane podczas aktywacji receptora na skutek ruchu TMH:VI. Zmiana położenia części cytoplazmatycznej TMH:V w stronę TMH:VII prowadzi do powstania wnęki po stronie wewnątrzkomórkowej opsyny, pozwalającej na wiązanie GαCT. Łańcuch boczny Arg:3.50 tworząc wiązanie wodorowe z Tyr:5.58, zmienia swoją orientację w kierunku wnętrza receptora. Pozwala to na bezpośrednie oddziaływanie naładowanego łańcucha bocznego Arg:3.50, z grupą karbonylową cysteiny obecnej na C-końcu wiązanej podjednostki GαCT. Dodatkowo, za stabilizację formy aktywnej receptora, jak i również powstałej wnęki, odpowiada Tyr:7.53 obecna w motywie NPxxY [2]. Pierścień Tyr:7.53 (która w stanie nieaktywnym oddziałuje z Phe:313 z helisy ósmej) skierowany do środka receptora, zapobiega zmianie położenia TMH:VI (Rys. 2).

==Literatura==
# Park, J.H., et al., Crystal structure of the ligand-free G-protein-coupled receptor opsin. Nature, 2008. 454(7201): p. 183-7.
# Scheerer, P., et al., Crystal structure of opsin in its G-protein-interacting conformation. Nature, 2008. 455(7212): p. 497-502.
# Knierim, B., et al., Sequence of late molecular events in the activation of rhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(51): p. 20290-5.
# Okada, T., et al., Activation of rhodopsin: new insights from structural and biochemical studies. Trends Biochem Sci, 2001. 26(5): p. 318-24.
# Modzelewska, A., et al., Arrestin interaction with rhodopsin: conceptual models. Cell Biochem Biophys, 2006. 46(1): p. 1-15.
# Liang, Y., et al., Rhodopsin signaling and organization in heterozygote rhodopsin knockout mice. J Biol Chem, 2004. 279(46): p. 48189-96.
# Vogel, R. and F. Siebert, Conformations of the active and inactive states of opsin. J Biol Chem, 2001. 276(42): p. 38487-93.
# Okada, T., et al., The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 A crystal structure. J Mol Biol, 2004. 342(2): p. 571-83.
# Fritze, O., et al., Role of the conserved NPxxY(x)5,6F motif in the rhodopsin ground state and during activation. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(5): p. 2290-5.
# Grobner, G., et al., Observations of light-induced structural changes of retinal within rhodopsin. Nature, 2000. 405(6788): p. 810-3.
# Sheikh, S.P., et al., Rhodopsin activation blocked by metal-ion-binding sites linking transmembrane helices C and F. Nature, 1996. 383(6598): p. 347-50.
# Farrens, D.L., et al., Requirement of rigid-body motion of transmembrane helices for light activation of rhodopsin. Science, 1996. 274(5288): p. 768-70.